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近年来随着技术不断更新，人群的高异质性和罕见类型细胞，在癌症、自身免疫病等疾病的发生、发展过程中的重要作用已才成为研究人员的共识。为了更好的理解和深入探索异质性和罕见细胞的生理性和病理性作用，单个细胞水平上的各种分析研究变得越来越重要。
作为2019十大科技创新技术之一，CODEX平台技术可以轻松实现40多种蛋白的同时染色，呈现单细胞水平的蛋白和细胞空间位置关系。PBMC(外周血单个核细胞)是一种常见的临床样本，其中免疫细胞种类和比列和个体免疫状态的紧密相关。
本期应用分享将显示使用CODEX对PBMC细胞涂片样本进行26种蛋白指标的染色和结果分析。
图一PBMC样本26种蛋白标志物自动化染色及成像
PBMC细胞悬液可按照Akoya推荐protocol进行固定、26种蛋白标志物抗体一次性孵育，自动染色和成像。在进行数据分析的同时，常见的免疫细胞marker可以按研究人员需要自定义组合，进行图像呈现。图二展示了CD45/Ki-67, CD3/CD19, CD3/CD4， CD4/CD8, CD11c/HLA-DR, CD11c/CD3/CD19的组合。在CD3和CD19的组合中，CD3 (T细胞特异性marker)和 CD19 (B细胞特异性marker)在观察的区域内没有出现信号叠加，提示抗体染色的特异性。
而在CD3/CD4的组合中，我们可以直接观察到CD3 (红色)和CD4 (绿色)的信号在部分细胞上有重叠，呈现为橙色，提示这部分细胞为CD4+ T 细胞，说明了CODEX在细胞及其亚型可视化分型的可能性。
图二 PBMC样本26种蛋白荧光标记图展示
仅凭肉眼观察的结果pbmc细胞，不足以支持科学的结论，需要进一步的数据精准分析和定量。Akoya的研发人员使用CODEX平台的开源数据分析软件MAV，按类似流式设门、分步深入分析的方法，对PBMC的染色结果进行了分析。图三展示了根据CD3的荧光表达强度，对T细胞进行进一步分型的流程，最终定义CD4+和CD8+细胞亚群，同时展示单细胞水平的对应图像。
图三 CODEX基于CD3阳性T淋巴细胞亚群分型分析
为了进一步支持分型分析结果的准确性，Akoya的研究人员对CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+T 细胞、CD19+B细胞和CD34+干细胞在PBMC样本中的比例进行了统计，并将其比例和公开数据库中对应细胞类型在PBMC中的比例范围进行了对比。对比结果显示，CODEX的分析结果都在参考范围的区间内。
图四对照组PBMC样本中不同免疫细胞分型展示
除了细胞分型，CODEX的分析软件MAV同时支持具体亚型细胞的定量分析。图五中Akoya的研究人员在之前分型的基础上对于多种亚型的免疫细胞在CD45+细胞中的比例进行量化。
图五 CODEX可对于CD45阳性免疫细胞精准分型定量
上述简单的分享可以说明，使用CODEX平台，可以轻松实现PBMC样本中26种指标的同时染色。在此基础上，各种细胞亚型也可以通过MAV软件分析进行定量和单细胞水平的呈现。在其他样本中，CODEX已经实现了40种以上marker的同时染色pbmc细胞，因此在PBMC样本的分析也可以不限于我们已经展示的26种指标。
如果您对上述分享中的任何信息感兴趣，或者有兴趣了解CODEX平台相关的技术信息，可以通过China@akoyabio.com 联系我们。我们诚待和您分享空间蛋白组学研究的前沿应用，和您共同探索更多应用的可能性。
关于Akoya Biosciences
Akoya Biosciences 生物技术公司专注于组织生物学标记物检测分析、肿瘤创新药物靶点发现及临床病例免疫诊疗创新检测方案开发，目前在美国波士顿和旧金山分别设有技术及产品研发中心，针对当前热点的肿瘤免疫相关研究致力于为全球客户提供先进的肿瘤组织免疫微环境分析解决方案。
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